CryoSPARC是当前冷冻电镜单颗粒重构的主流软件之一，它的界面交互十分友好。本文采用一套铁蛋白apoferritin的数据作为testdata。我们服务器路径在/data/testdata/apoferritin下。有需要的可以通过网盘下载:
提取码：CRYO。百度限速不方便的话去empiar数据库找一套铁蛋白（比如）下载几十张练手也是可以的，网速可能会快一点。
新建
这是CryoSPARC v4.4的主界面，CryoSPARC用户端通过Web网页访问。
点击上方绿色的New Project按钮可以新建Project。
Title输入你想取的名称，然后选择Project保存的路径（在数据盘里创建一个自己的文件夹），它会在选择的文件夹内创建一个”CS-Title”的文件夹，所有的运算结果都在这个文件夹下。点击Create新建。
进入Project之后，创建一个Workspace，取一个名字。不同worksparce之间是可以通过link job来互相访问计算的结果的，所以类似蛋白的不同数据可以放在一个Project里，方便引用模板匹配或者三维模型，分成不同Workspace方便分类和查找自己的任务。
右上角Detail显示Workspace或者Job的信息，锤子形状的按钮是Builder，可以新建所有类型的Job。
导入数据
冷冻电镜收集的原始图片一般是以Mutiframes Movies形式（比如tiff、eer格式）。
如果在收集的时候就做过Motion Corretion，或者在别的软件里比如RELION、MotionCor2等做过Motion Corretion，那么文件就是mrc格式的Micrograph，直接选择Import Micrograph就行。
这里我们从头开始，点击Builder，在里面选择Import Movies。
点击Movie data path右边的文件夹图标，找到自己的原始数据位置，选择其中一张照片，然后在路径里改成*.tiff或者*.eer，回车。当前目录下全部Movies都被选中了。点击Select。
注意：*代表该文件夹下全部文件，为了防止一起导入当前路径下有gain或者其它文件，写*.tiff保证导入的都是以tiff后缀的Movies。
如果文件分布在许多子文件夹内，也可以用*来代替文件夹，比如EPU默认收回来的数据，可以选择类似输入
/path/to/Supervisorxxxx/Image-Disc1/*/Data/*.tiff
然后，点击Gain reference path右边的文件夹图标，选中gain文件xxx.mrc。
CryoSPARC能用.gain或者.mrc后缀的gain文件。如果收集回来的gain文件是.dm4格式的，用eman2的e2proc2d.py脚本转化格式。
e2proc2d.py gainfile.dm4 gainfile.mrc
然后将电镜收集参数填完（这些参数在收集冷冻电镜数据的时候就要记下来）。
Rotate gain ref? 一般我们收的数据gain flip和rotate都不用管，都是正的。这套tutorial的数据需要旋转90度。输入1代表旋转一次90度。
Raw pixel size (A) 像素大小
Accelerating Voltage (kV) 加速电压
Spherical Aberration (mm) 球差系数
Total exposure dose (e/A^2) 总电子剂量
填好参数后点击点击Queue Job然后点击Queue。
可以看到这就是我们的原始图像。点击窗格左上角显示这个Job详细信息。如果正在Build这个Job，右下角点击Stop Building可以退出，再点击Build可以继续调整参数。
漂移校正
点击Builder并选择Patch Motion Correction。
然后在左边Workspace中点击Import Movies那个Job的左上角，这时显示Import Movies这个Job的详细信息，右边是MotionCorrection Job的Builder信息。
鼠标左键按住Import Movies Job右侧Output Groups中的Import Movies，此时右侧的Input框会变绿，拖住Import Movies并放入Input。
这种拖动操作在CryoSPARC中十分常用，下文不再重复。
在Parameters中将Output F-crop factor选为1/2。由于数据是以Super-resolution模式收集的，这个是bin2。如果实际收的数据没有用Super-resolution模式，可以不用管这个参数。
CryoSPARC-v4.0之后新增了一个Save results in 16-bit floating point的功能，将原来的float32结果保存为float16，从而节省50%的存储空间并加快运算速度，同时对结果几乎没有影响，推荐勾选上。
点击Queue Job然后点击Queue。
计算CTF
点击Builder并选择Patch CTF Estimation。
类似于上一步，点开Motion Correction的结果，将其OutputGroups中的Micrographs作为Input拖入Patch CTF Estimation的Inputs框内。参数默认就行。
Queue Job。
筛选照片
在数据收集过程中可能会有一些冰污染严重、像散高、位置偏移等问题的照片，可以筛选剔除，保证后续计算质量。
点击Builder选择Manually Curate Exposures。将CTF estimated的Micrographs作为Input Exposures。Paticles那一栏可以不管，它写着Min：0就是允许没有Input。参数默认。
Queue Job。
可以注意到在Builder页面中，Manually Curate Exposures右侧有一个的Interactive标签，Queue后就会显示成”waiting”的粉红色状态。这种Job就是需要交互的手动Job。点击Job左上角打开详细信息。
打开后会显示如下的交互界面。右边有三个选项Thresholds、Micrograph、Diagnostics。
Thresholds可以通过调整阈值来批量选择、丢弃照片。Micrograph会显示单张照片。一般电镜照片都是成千上万张，所以大部分时候会用Thresholds快速筛选明显有问题的照片。比如这里在CTF fit resolution里看到两个明显离群的照片，值异常大。鼠标放到上面显示照片就能看出这张照片明显有问题。一种方法是在左侧选中这张照片的行（Row），然后点击右上角Reject舍弃掉。另一种方法是在Thresholds里选中CTF fit resolution，设置阈值的范围在2Å-6Å然后点击Set Thresholds，这样两张异常的照片就都Excluded了（显示橙色）。
点击右上角Done完成。右侧Output就可以看到25张照片accepted，2张rejected。
颗粒挑选
挑选颗粒是选出颗粒的坐标，然后用Extract From Micrographs将其从一张大的照片中以一个小框扣出来。一般常用的有Manual Picker手动挑选，Blob Picker通过给定颗粒大小自动挑选，Template Picker以给定的二维模板来挑选颗粒。
颗粒的挑选以及分类往往决定了后续三维重构、分类、细化的质量和结果。CryoSPARC中还有一些别的颗粒挑选的方法，比如通过深度学习训练等新的方法。
Blob Picker非常简单，直接给颗粒大小就自动挑选，它会创建一些直径的圆并作为颗粒模板。点击Builder并选择Blob Picker。将Manually Curate Exposures里accepted的Micrographs作为Input。并且在Minimum particle diameter和Maximum particle diameter参数里给出颗粒的大小范围（单位是Å）。如果你的颗粒不规则就要考虑到不同方向的投影可能大小不同。
Queue Job。
Blob Picker的结果有的时候不一定尽如人意，有大量的坐标都是选择了空的位置或者碳膜上。
我们可以在这里用Inspect Particle Picks这个任务来调整一下。创建Job，然后将Blob Picker的结果输入进去并Queue。
可以看到在左下角有一个可以拖动的条Power Histogram，用来设置阈值。阈值的低值往上拉可以将大量空的位置筛选掉，阈值的高值往下拉可以将信号特别强的冰颗粒去掉。点击Done Picking。
颗粒提取
Pick输出的只是一个XY坐标，要后续进行计算需要颗粒的照片，需要通过这个坐标以及给定一个正方形框Box将颗粒提取成一张张小的照片。
点击Builder并选择Extract From Micrographs。
前面Inspect Particle Picks结果里有两个Output Groups：Micrographs和Particles。分别作为Extract From Micrographs的Input Micrographs和Input Particles。
然后修改Extraction box size。这个参数代表提取颗粒的box大小，至少需要比你的颗粒直径大。比如我这里已知铁蛋白的大小是120 Å左右，pixel size是0.495×2=0.99 Å/pix。那么给个150-180 pix的box大小就足够了。注意单位，用你的pixel size参数来进行pix和Å之间的转化。
将Save results in 16-bit floating point勾选上。能节省一半的存储空间并提高计算速度。
Queue Job。
二维分类
点击Builder并选择2D Classification。将Particle Extraction的Output-Particle Extract作为Input输入。参数Number of 2D classes是要分的类数目。默认是50。如果颗粒多的话可以增加分类的数目来获得更好的效果，但是也会增加计算时间。
Queue Job。这步和Extract From Micrographs一样需要较长时间，可以在Extract From Micrographs还没做完的时候就把这个任务创建好并Queue上，它到时候会自动执行下一步。
点击Builder并选择Select 2D Classes。将刚刚的二维分类2D Classifications的两个Output（All particles和2D class averages）作为Input输入。
Queue Job。这也是个Interactive Job。
选择自己想要的二维平均，点击Done。
在实际的数据处理过程中，往往一轮二维分类无法达到好的效果。挑选好的二维类，然后用Selected Particles作为输入再进行二维分类。循环直到达到满意的效果。
（可选）用模板挑选颗粒
理论上有了Particle stack，就可以进行三维重构了。这里再展示另一种挑选颗粒坐标的方法。
我们有了刚刚二位分类结果的模板，就可以进行Template Picker了。点击Builder并选择Template Picker。
将刚刚Select 2D Classes里Output-Templated Selected作为Template Input。
将Curate Exposure-accepted作为Micrograph Input。
然后输入颗粒大小Particle Diameter（铁蛋白120Å）。
Queue Job。
然后和之前步骤类似，用Inspect particle剔除假阳性颗粒，提取颗粒Extract Particles，二维分类2D Classification，选择分类Select 2D Classes。
除了这种挑选颗粒生成2D template，还有另一种方法生成template。如果你之前已经有了这个蛋白类似的3D map。点击Builder并选择Import Volume。然后用Create Template任务可以将3D Volume进行2D投影，从而生成2D Template。
三维重构及分类
Ab-initio可以从Particle stack从头开始生成初始三维模型，后续再用这个模型可以用来三维分类或者细化。
点击Builder并选择Ab Initio Reconstruction。
将最后一轮Select 2D Classes作为Particle stacks输入。
Number of Ab-Initio classes可以填入想要生成几类不同的map，在v4.0版本之前的CryoSPARC中还没有3D Classification，Ab-Initio & Heterogeneous refinement本身也是三维分类的方法之一，可以分出构象差别较大的类，剔除二维分类中没有用的杂颗粒。
铁蛋白是高度对称的球体，我们在Symmetry给个对称性O。在处理自己的数据的时候，除非特殊情况，最好不要在前面就施加对称性，可以到最后refine再考虑。
Queue Job。
点击Builder并选择Heterogeneous Refinement。将Ab-intio结果中每个class的Particle和Volume都拖进Input中，至少需要两个Volume来进行分类。
现在CryoSPARC中有Quick Action的功能，鼠标右键点击Ab-intio的结果，会有一个Build Heterogeneous Refinement的选项，一步到位。其他的任务右键点击也有自己的对应的快捷创建任务，可以都去试试。
Queue Job。
注意！在Ab-intio从头生成3D map过程中，可能会出现生成的map手性错误的现象，可以用Volume Tools选Flip hands可以将Volume的手性翻转。然后用正确手性的map替代掉那个错误的map来做Heterogeneous Refinement。
Refinement
Heterogeneous Refinement为了分类而限制最高分辨率以达到良好的分类效果。3D Refinement能够将分辨率进一步提升。
常用的有两个Job，经典的Homogeneous Refinement和Non-uniform Refinement。Non-uniform Refinement是对小蛋白和膜蛋白是可以有更好的优化效果。
这里我们选择Homogeneous Refinement，一般而言速度会比Non-uniform refinement快。选择Heterogeneous Refinement结果中较好的class，Particle stack颗粒集和对应的Volume map作为Input。
同样Symmetry给个O对称性。
由于铁蛋白本身是个标准蛋白，又给了高对称性，所以很容易就到了2.5A的高分辨率。
点击Output里一个云和一个箭头的图标可以下载结果。
map就是获得的密度图。
map_sharp是sharpen后的map，在job的详细信息Guinier Plot里可以看到map sharpen BFactor。
map_half A/B是half map。软件会把颗粒随机分成两部分计算，根据相关系数来判断分辨率，就是详细信息里的GSFSC Golden Standard Fourier Shell Correlation。常见的有用0.143或者0.5作为阈值衡量分辨率。现在上传pdb数据库已经必需上传half map了。
局部CTF优化
Local CTF Refinement会对每一个颗粒的局部CTF做一个校正，有可能进一步提高分辨率。将Refinement的Particle和Volume输入Local CTF Refinement。然后将Local CTF Refinement输出的校正过的Particle stack和前面Homogeneous Refinement的Volume作为输入重新做一次Homogeneous Refinement。这里并没有提高分辨率，可能已经到极限了。但是在实际运算过程中这一步往往都能提高不少分辨率。
评估结果
发表文章中可能需要一些数据和图片来对结果进行评估。比如Local resolutiont，将最终Refinement的结果输入。在结果中选择那个叫做map_locres的下载，在ChimeraX等软件中可以展示。下载后同时打开map_sharp和map_locres。上方工具栏选择Tools-Volume Data-Surface Color。弹出工具栏后Color surface选择map，选择by volume data value，using map选择locres。颜色输入对应分辨率。点击color。具体的ChimeraX软件操作详见ChimeraX的操作指南，这里不细说。
还可能需要3DFSC histogram，4.0以后的新版的CryoSPARC将ThreeDFSC删除了，但是有Orientation Diagnostics。将最终Refinement的Volume作为输入就可以。
