Phenix，全称Python-based Hierarchical ENvironment for Integrated Xtallography，是一个用于晶体和冷冻电镜结构测定的综合软件包，是辅助结构搭建半自动化的软件之一。使用起来也十分方便，上手很容易，因为大部分过程都是自动的。
Phenix对学术用户是免费的，可以在申请许可后下载。下载后安装也是简单的一路yes。
本文以Phenix v1.20为例，聊聊几个常用的功能。
新建
打开Phenix，点击New project，或者第一次打开Phenix，输入名字和保存路径即可。Phenix会在目录下创建一个.phenix的文件夹用于识别以及存储这个project的配置。
这个就是Phenix的界面，不同的Jobs根据类型分类。Favorites可以存储常用的Jobs。
如果安装过Coot和PyMol，在左上角File-preference-Graphics里可以添加Coot和PyMol的执行程序的路径，这样就可以在Phenix中直接打开这些软件，使用Coot和PyMol可视化结果。
Real Space Refinement
这是用的较多的一个程序，这个程序能基于map对model整体进行优化，包括精细的fit和立体化学校正。
选择add添加map、model，如果model里有不在默认化合物库中的ligand，还需要添加ligand的cif限制文件。cif生成下面eLBOW会说。
这里拿pdb号6out的结构以及对应map EMD-20205为例。
Resolution输入map的分辨率。Job title可写，方便自己识别。
转到Refinement Settings。这里可以调节各种Refine的参数。正常情况下默认的参数就能够有比较好的效果。
由于默认勾选了Use secondary structure restraints，使用二级结构限制，我们需要给出二级结构的范围。如果输入的pdb文件中带了HELIX/SHEET信息，它会自动读取pdb文件中的HELIX/SHEET信息。如果没有，Phenix也有从输入的结构里搜索二级结构的功能。
点击Select Atoms。
在Selection Editor中点击Find Secondary Structures，直接点击OK用默认参数搜寻二级结构。然后点击Save and close。
所有参数设置好了，点击Run。输出结果保存在Project目录下，有一个修正好的pdb结构。下方Open in Coot可以直接在Coot中打开。点击结果里的Validation选项，可以看到评估结果。
Summary中显示了整体的参数数值，包括Composition (Atoms, Residues, Water, Ligands), Bonds (RMSD), MolProbity score, Clash score, Ramachandran plot, Rotamer outliers, Model vs. Data CC等发表文章时需要在Validation Table中展示的数据。
MolProbity中具体显示了哪些可能有问题的、待修正的氨基酸。包括Clashes、Rotamers、Ramachandran、Bond等Outliers。
大部分情况下，Real space refinement会在restraints的限制下，对model的主链、侧链、键长键角以及立体化学性质进行修正，达到一个较好的水平，但是也存在一些问题、错误和局限性。
① Real space refinement可能会有各种报错，排除软件本身bug，也可能是给的model有问题导致的。
一个可能报错的原因就是缺失cif限制文件，会显示有未识别的原子。看看是不是缺少了哪个model中搭建了的ligand，不在默认的化合物库中，还没有提供相应cif文件。有的时候ligand和cif虽然对应，但是ligand的原子命名和cif的原子命名不匹配也无法识别。比如eLBOW用smile chemical string生成的cif和库里的cif命名就不同。
此外，model最好是标准格式的，前期最好不要添加ligands，如果需要可以使用记事本打开pdb文件删除一些识别不了的条目。
② 对于原本有大范围偏差、偏差较大的位置可能没有很好的修正效果。整体的fit还是在ChimeraX或者Coot里直接手动调整比较合适。
③ 对于一些大侧链比如Trp，有时候不能很好地摆正Flip sidechain。常常会出现Trp的密度很好但是会有侧链翻转180°的现象。这种错误一般都能够在Coot等软件中直观地看到，将其修正过来。
④ 对侧链Rotamer outlier的修正效果在默认参数下有时候会不尽人意。虽然Real space refinement在分辨率较好的情况下能修正大部分的侧链rotamer outlier，但是还是会有一部分的侧链每一次refine都会被调成异常的rotamer。尤其是酸性氨基酸侧链，由于冷冻电子显微镜本身的局限，辐照损伤导致的酸性氨基酸缺失密度，有很多位于外侧的酸性氨基酸密度较差，导致在做完Real space refinement后rotamer outlier很高，后续手动调整就行。
Comprehensive validation (cryo-EM)
如果只是想做一个Validation，看看有问题的氨基酸或者是生成Validation Reports，而不做refine，那么选择Comprehensive validation (cryo-EM)。
只需要输入model map，有化合物库之外的ligand的输入自定义cif。输入Resolution。点击Run。
结果和Real space refinement里的Validation类似，就不再次说了。
eLBOW
首先要说的是，对于常见的ligand，Phenix和Coot都是由内置cif的库的，直接跑Real space refinement和Validation都是可以的，只有当用一个新的小分子，或者默认的库不合适的时候才来使用这个。因为eLBOW生成的cif有的时候也不是正确的。
eLBOW (advanced inteface)有更多参数可选，这里就只说advanced了。
打开eLBOW advanced，一般我们可以通过SMILE格式生成cif，这是一种小分子的正则化表示方式，可以在PubChem、RCSB PDB等网站中找到。
以ATP为例，在Chemical string中输入网上搜索到的SMILE。
然后在Output ligand ID中输入三个字母的名字。
点击Run。
最终会输出ATP的pdb和cif文件。
还有另一种更容易的方法，回到Configure，点击中间的那个Search chemical component database。这个可以在数据库中直接搜索小分子。
输入ATP，点击Search。点击结果中第一行的ATP，然后点击View in REEL。
这个就是数据库中的ATP以及键长键角参数。点击右上角的eLBOW Optimisation。
自动打开了一个新的eLBOW advanced界面，由于是从REEL中跳转过来的，直接点击Run就行。
不过一般这种方法能搜到的ligand，默认库中都有。
Combine Focused Maps
在冷冻电镜数据处理过程中，对于一些柔性较大的区域常常会做Local refine以提高局部分辨率。这个程序可以把不同的Focused maps合并成一个map，保留了Local的高分辨率结构同时又是完整的map。
自带的简介已经写的很清楚了，这个Job需要输入一个主要的map和一个主要的model，通常也就是整体的低分辨map和整体model。然后点击+号可以添加局部的maps和models。
程序会根据model和map进行对齐，匹配得越好的部分会获得更高的权重，最终对map进行合并。
最后会生成一个ccp4格式的map。
其它小工具
这里面有一些修改model的小工具，像PDB Tools PDB file editor可以快速更改修正pdb文件的原子命名、链名、Seg等等参数，Combine PDB可以把两个PDB文件merge。都是一些虽然没啥大用，但是有可能用到并减少工作量的小工具。
除了提到的Jobs，Phenix还有好多工具，都有着各自的作用，许多都可以半自动化，提高结构搭建的效率，减少工作量，可以慢慢摸索。电镜结构搭建时主要经常用的几个程序就是文中提到的这些。
refine自定义限制
在Phenix refine中，Input PDB中所有的LINK，SSBOND，CONECT限制都是自动忽视的，因此想要在refine过程中人为给定义的话就要用特殊的方法。大多数常见的键长键角几何限制都已经在CCP4 monomer库中定义好了，这也是Phenix refine默认调用的parameter。可以通过类似的写法写一个.param后缀的文件来添加额外的键长键角限制。
比如要限制两个His和HEM形成的配位键。新建一个文本文档，根据phenix的语法格式定义键长键角，把文件后缀改成.param。然后在refine程序中选中这个文件，Data Type会自动识别成phil配置文件。
refinement.geometry_restraints.edits {
fe = chain C and resname FE and resid 1000 and name FE
his1 = chain C and resname HIS and resid 99 and name NE2
his2 = chain C and resname HIS and resid 198 and name NE2
bond {
action = *add
atom_selection_1 = $fe
atom_selection_2 = $his1
symmetry_operation = None
distance_ideal = 2.28
sigma = 0.02
slack = None
}
bond {
action = *add
atom_selection_1 = $fe
atom_selection_2 = $his2
symmetry_operation = None
distance_ideal = 2.28
sigma = 0.02 slack = None
}
angle {
action = *add
atom_selection_1 = $his1
atom_selection_2 = $fe
atom_selection_3 = $his2
angle_ideal = 100
sigma = 5
}
}
简单解释一下格式，以refinement.geometry_restraints.edits开头，表明这个一个几何限制文件。然后是原子的选择，可以自己给名字代号，然后根据chain-resname-resid-name分别定义哪条chain的哪个residue name，对应的residueid，以及这个residue中的哪一个原子。这个可以用记事本打开pdb文件找到那个原子的信息。