在处理电镜数据的过程中，由于蛋白质往往存在柔性和刚性的区域，会遇到某个关键的区域分辨率不佳的情况，这可能是由于该区域柔性相对较大导致的。
这时候通过局部细化Local Refinement在许多情况下能很好的解决问题。
Local Refinement需要创建一个Mask包裹想要细化的区域，以及另一个Mask包裹需要减掉的区域。在目标区域内进行Refine获得更高局部分辨率。
这里参考CryoSPARC官网的一套Tutorial，用的是EMPIAR-10073的一套酵母U4/U6.U5 tri-snRNP的冷冻电镜数据，是已经经过初步的分类将坏颗粒剔除掉了的Particles数据集，可以直接在EMDB数据库下载，约70G左右。
附上官网教程：
下载并导入数据
用wget命令从EMDB数据库下载数据。
wget ftp://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10073/data/*.mrcs
以及对应的STAR文件。
下载后会有后缀为mrcs的particle images和后缀为star的文件，在CryoSPARC中Build>Import>Import Particle Starck。
在Particle meta path参数中选择下载的shiny_correctpaths_cleanedcorruptstacks.star（官方Tutotial里给的star文件有几个对应的images缺失了，如果报错，用文本编辑器打开star文件删除对应的条目即可）。
在Particle data path参数中选择存放数据的目录。
注意在star文件中写的索引路径是Particle/*.mrcs。因此需要在工作目录（我这里是/data/testdata/10073）下建立一个名为Particle的目录并把数据放进去，这样根据star文件索引的时候才能搜索到数据。
其余参数默认。
Refine和Local Resolution
这套数据由于已经经过了初步分类，可以在一切默认参数下直接运行Ab-initio加上Homogeneous Refinement就可以达到3.6Å左右的分辨率。柔性较高的结构用NU-refinement会好一些，能到3.55Å左右。
我们会发现这个结构中心区域局部分辨率明显较高，而头部和尾部分辨率基本大于6Å。
创建mask
接下来需要在ChimeraX里创建一个包裹想要进一步细化区域的Mask和一个包裹其它需要减去区域的Mask。
打开NU-Refinement生成的Map。先用高斯滤波将Map平滑。平滑的mask很重要，没有低通滤波的mask包含高分辨率信息，后续的refinement可能会仅根据mask而不是volume本身在half map之间产生虚假的相关性，这会导致虚高的GSFSC，所谓的overfitting。
volume gaussian #1 sDev 2
然后使用Segger工具将volume分区。在ChimeraX中点击Tools - Volume Data - Segment Map。在弹出的框中选择刚刚生成的高斯滤波的volume，然后点击Segment。
map已经被分成了多个区域，现在需要做的是选中头部区域的块，操作详见ChimeraX使用。
Ctrl+Shift+鼠标左键可以连续选中区域，然后点击Group可以把多个区域合并成一个区域。点击Hide/Show/Delete就是对应的隐藏/显示/删除。差不多达到这个效果：
这样生成的volume的box size是不对的，我们需要把它调成和我们原始map相同。这里#4是要保存的mask，#1是最开始的map。
volume resample #4 ongrid #1
这样就会生成一个新的#5的map，保存它，然后上传到服务器上。
扩张和填充
回到CryoSPARC，选择Import 3D Volume。参数默认，把上传的map给import进去。
然后再创建Volume Tools，将刚刚import的map输入进去，参数上Type of output volume选择mask，Threshold选择一个在ChimeraX中打开看着能覆盖区域的Contour level，这里给0.05，Dilation radius和Soft padding width就是扩张和填充，分别给5和17。这个job将会将map二值化为mask，同时向外扩张5个pixel，同时用17个pixel的软边缘填充。填充半径大一些会保证mask的质量，但是太大会导致对感兴趣的区域的对齐效果下降，可以从大了往下试。默认值是13。
寻找支点（可选）
CryoSPARC的Local Refinement允许指定感兴趣的Volume可以围绕其旋转的”支点”。使用支点的位置坐标，CryoSPARC将重新计算局部角度搜索网格，使其更加准确。这相当于在每个粒子图像中将粒子重新定心到支点的位置。一般情况下这个差别不会很大，平时可以先直接省略支点，默认效果很差再考虑这个。
默认情况下是围绕mask的中心旋转。当mask覆盖总volume的很大一部分时，这样效果会比较好。这个教程里头部区域没有覆盖volume的很大一部分。在这种情况下，最好围绕box的中心旋转粒子，因为这更接近真正铰链运动。当mask覆盖中等大小volume时，围绕box中心的旋转往往效果更好。没有一个最佳答案。直觉告诉我们，头部应该围绕头部和身体界面上的某个点旋转。
我们可以用ChimeraX找到这个点。打开ChimeraX，下载这个生成的mask。在上方工具栏找到点击Markers - Surface，然后在差不多的旋转点上右键点击一下。在右侧日志栏就会显示这个点的坐标。注意单位是Å，要换算成pixel，除以pixel size就行。输入info #1可以显示。
在后续的Local refinement任务里把这个坐标输入到fulcrum就行。
Particle Subtraction（可选）
Particle Subtraction从NU-Refine或Homogenous Refine中获得的整体结构，并从原始Particle images中减去其Mask区域的投影，创建一个Subtract后的Particle stack。这些Particles可以用于Local Refinement，现在减去了不需要的信号，对齐将仅基于Focused区域，获得更好的对齐。
在ChimeraX中类似于上面创建头部mask的过程，这次创建不想要区域的mask，后处理的步骤与前面一致，但是在扩张和填充时，我们不希望把周围的信号都减掉，只希望减掉主体蛋白信号，因此扩展参数dilate radius可以不要，但是padding是必须的，给到推荐最小值12（5*resolution/apix）。
导入并处理好mask后，选择Builder - Local Refinement - Particle Subtraction。将前面做的NU-Refinement的Particles和Volume作为Input，把处理过的包括除了头部Mask之外所有区域的Mask作为Input。这样就可以生成一个新的Particle stack数据集，只留下了头部的信号。
这时候如果做一个Homogeneous Reconstruction Only的任务，我们很快就能看到其余部分被减掉了。
Local refinement
然后选择Local Refinement。用刚刚Subtract的Particle Stack作为Particles Input，NU-Refinement的Volume作为Volume Input，处理过的头部Mask作为Static Mask Input。如果没有做Substract，直接用NU-Refinement的particle就行。
最终能获得一个3.8Å左右的head局部分辨率。
合并
可以用ChimeraX的vop maximum命令或者Phenix的Combine map把局部map和整体合并。