样品制备
大多数生物样本都在水环境中，水分子随着冷却会逐渐形成六边形的固态晶体冰，它的密度比液态冰要小，体积要大，在晶体形成时会对生物样本造成破坏。
六边形的晶体冰是通常情况下常见的形态，但是冰还有另一种形态是玻璃态，在快速冷冻的情况下，水分子还没有排列成冰晶之前被固定下来，只要温度低于-135℃，玻璃态就能够保持。
玻璃化受到样品热传导效率、溶质浓度、样品厚度和环境压力的影响。使用防冻剂可以阻碍晶体冰的形成，但是会影响样品的超微结构。增加溶质浓度也可以延长晶体冰形成的时间。常规的投入式冷冻可以形成约500 nm厚度的玻璃态冰，一般足以制备蛋白大分子、病毒、甚至一些单细胞样品，高压冷冻可以在高压下形成更厚的样品。
液氮在常压下的温度很低能达到-196℃，价格便宜且容易获得，但是它的导热性和比热容非常低，一旦接触到其它高温物体，就会快速沸腾，在液氮和样品之间形成一层氮气层，防止其快速冷冻，这被称为Leidenfrost效应。
所以冷冻需要别的介质，乙烷和丙烷就是比较好的选择，它们的沸点高得多，所以不容易气化，乙烷的冷冻效率略优于丙烷。可以使用液氮来冷却它们液化。需要注意的是乙烷和丙烷非常易燃，使用时要注意安全。
| 冷却剂 | 沸点 ℃ | 凝固点 ℃ |
|---|---|---|
| 液氮 | -196 | -210 |
| 乙烷 | -89 | -183 |
| 丙烷 | -42 | -188 |
电子探测器
电子显微镜使用电子探测器来接受信号，探测量子效率（DQE）是评价成像系统信噪比和性能的重要指标。探测器大约经历了三次迭代：
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传统的胶片DQE很高，但是操作效率很低，需要大量人力，后来被数码相机给取代。
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闪烁体（Scintillator）将电子转化为光子，通过一层光学纤维，然后使用电荷耦合器件（CCD）相机检测，但是DQE很差。互补式金属氧化物半导体（CMOS）相机一定程度上提高了DQE和速度，但一开始用的还是闪烁体和光纤的方法。
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直接电子探测器能够直接接受电子信号，拥有更高的DQE。单片式有源像素传感器（MAPS）是基于CMOS的探测器，经过辐射硬化以能够直接承受电子束。MAPS的敏感层通道非常薄，减少了电子在传感器内的横向传播散射，支持更小的pixel size。另外，检测和读取发生在单层中，使得能够快速和连续地记录电子信号。快速的读取速度支持了照片内多帧分级电子剂量，保留DQE和信噪比最佳的图像。
直接电子探测器深刻影响了冷冻电镜领域，推动了通用高效的高分辨单颗粒重构。
衬度传递函数
由于波粒二象性，电子可以被视为波，其散射规律可以和光波一样解释，电子显微镜使用电子束作为光源成像，常常可以用波的概念来理解电子显微镜的规律。
显微镜的像差、欠焦等导致样品的真实结构信息在成像过程中会发生变化。衬度传递函数（CTF）就是用来描述这种变化的数学模型。
衬度
衬度/对比度（Contrast）是指图像中不同区域之间的明暗差异。
电子与样本发生相互作用，有三种主要的相互作用类型：未散射电子、弹性散射电子和非弹性散射电子，它们一起形成了最终的图像。
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未散射电子（透射电子）是在样品的原子之间穿过，不与它们相互作用，因此速度和方向不变。大部分是这种。
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弹性散射电子是与样品相互作用，但是并没有损失能量，方向会发生偏转。
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非弹性散射电子是与样品相互作用，损失部分能量，速度变慢，方向发生偏转。
电子显微镜中的衬度可以分为相位衬度和振幅衬度：
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振幅衬度：当电子束穿过样品时，部分电子被样品吸收或散射，导致透射电子的强度减弱。这种强度变化在图像中表现为明暗差异。
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相位衬度：当电子束穿过样品时，不同区域的电子会因为样品而产生不同的相位差，在成像过程中互相干涉而在图像中形成明暗差异。
像是负染电镜的话，因为有重原子，所以振幅衬度就会比较明显。
冷冻电镜中，由于生物分子和环境水分子的组成原子差不多，对电子的振幅影响差异不大，形成的衬度不强，因此主要考虑相位衬度。
相位衬度
入射电子打到样品上，大部分电子直接穿过样品，称为透射电子或非散射电子。
一部分电子因为和样品相互作用发生了散射。散射角度遵循布拉格定律：
λ是入射电子的波长在这里不变，d是特征大小，θ是角度。
更精细的样品特征，也就是更高空间频率（分辨率）的特征，对应散射电子的散射角度就会更大。
样品不同位置的同一分辨率的散射光，散射角度相同，平行光在透镜的后焦平面上会汇聚到一个点上，这样相同半径的圆上代表相同散射角的散射波，也就代表了相同分辨率的散射光，就会形成一个径向圆的图，越往外半径越大的地方，代表了越高的分辨率，后焦面上就是图像的傅里叶变换。
样品同一位置的不同分辨率的散射光，和透射光在像面上会聚，散射光携带着样品的信息，复原了原来的图像。
散射波在出射时就有90°相位延迟，这个是对于生物样品这种弱相位物体的近似计算。再考虑不同散射角度，电子束的传播路径长度也不一样，也造成了相位的差异。比如传播路径多了1/4个波长，那相位又再次多出90°的延迟。
散射角很小的散射波有初始相位差90°，但由于散射波振幅强度比较弱，所以只对结果造成了一点相位偏转，振幅影响不大，对比度几乎为0。
往后一点相位差到180°的时候，振幅减弱最大，此时为最大负对比度-1。
再往后，相位差到360°的时候，振幅增强最大，此时为最大正对比度+1。
用向量表示波可能更直观一些，长度代表振幅强度，方向代表相位。散射波初始相位差90°的时候，两个向量叠加，对于透射波的强度方向改变最小。相位差180°的时候是全部减去，对其强度减弱最大。相位差360°的时候，全部叠加到相同方向上，强度增强最强。
散射光相较于透射光强度很低，造成的相移程度也很小，可以通过欠焦引入额外相移。
欠焦通过移动检测器到像面下方，使得电子束的路程发生了改变，相位发生改变，改变了相位对比度。
另外，球差是指近轴电子束和远轴电子束无法会聚到一点上，也会引入相位差。
衬度传递函数
将不同角度的散射光代表的空间频率（倒数为分辨率）和透射光散射光相干产生的相位对比度作一个函数，就是衬度传递函数CTF。
经典CTF的公式是：
Cs是球差系数，f是空间频率，λ是波长，δ是欠焦。
波长由加速电压决定，300 kV下电子的波长约为0.0197 Å。
球差是电镜的属性，球差越小分辨能力越强。但是球差和空间频率四次方成比例，所以要到1Å以上的高分辨率区域才有更明显的作用。如果考虑像散等更高阶的像差，还能将CTF展开为更高阶的近似，那些就是在非常高分辨率计算中需要考虑的。
如果代入不同的欠焦值，CTF图像会有变化。分辨颗粒形状主要来源于低分辨率信息，在空间频率靠前的某一低分辨率下画一条竖线，欠焦越大，对应的衬度绝对值越大，也就意味着颗粒对比度更强更明显。欠焦为零时低分辨率的特征几乎没有，就会很难分辨特征轮廓。
但是能看出来，欠焦越大，CTF曲线越往低空间频率方向靠，高空间频率方向上的震荡会更加明显。现实情况下，电子显微镜电子束的能量和方向都不是理想的平行和均匀的，这类成像系统误差合并被描述为包络函数。实际的CTF要乘以这个包络函数：
高空间频率下衬度会不可避免衰减，直到无法分辨信息。
所以，欠焦会使得低分辨信息更强，包络函数会使其高频信号衰减的更快。欠焦使得震荡更快也会导致零点更多，丢失的信号更多。近焦的高频信号震荡更慢，更能够恢复高分辨信息。
CTF校正
在收集完数据后，对图片进行傅里叶变换，得到的功率谱径向平均后获得1D的功率谱，然后在将其与不同欠焦的CTF进行拟合，计算出拟合效果最好的CTF来还原其理论CTF，这样就获得了这张照片的欠焦值。
2DCTF和功率谱理论上是圆的，但是电镜的各向异性像散会使其在不同方向不均匀，变得椭圆。因此可以从二维傅里叶变换判断电镜的像散，通过2D CTF拟合来校正像散。这也是为什么不能仅仅拟合1DCTF。
可以这样理解，把1D CTF函数的压缩到一条线上用灰度表示，然后绕着中间转一圈，就获得了2D CTF。
把图像数据进行傅里叶变换，得到图像的功率谱，径向平均生成1DCTF。
2DCTF的理论模型和1DCTF基本相同，但是由于x和y方向的欠焦不同，需要考虑等效欠焦，s是某个散射分量，α是其与x轴角度，u和v分别是两个方向上的欠焦，αastig是像散角。像散值就等于两个方向欠焦的差值。
通过这一步的拟合效果可以计算图片的欠焦值，拟合分辨率、像散，然后对图片进行筛选，剔除一些不好的图片。
在后面的平均和分类中，需要还原图片原始的信息进行计算，此时用收集的图片除以拟合最好的理论CTF，就可以还原出衬度为1的理论信息值。
可以注意到CTF和x轴的交点是0的位置，意味着衬度为0，这些零点无法通过除以CTF还原。CTF的零点缺失无法从单张图像中检测出来，但是可以通过在不同欠焦下拍摄图像来将信息损失分散开，组合这些图像来恢复缺失的空间频率信息。在收集冷冻电镜数据的时候需要给定一个欠焦的范围，收集不同欠焦下的数据。
相位板
上述的CTF都是没有考虑相位板的，有些电镜装了相位板。相位板仅对散射电子而不是透射电子引入了额外的相位差来提高相位衬度，在CTF公式中加上相位Φ。
能量过滤器
非弹性散射的电子的干扰会增加图像的背景噪音，影响图片衬度，对样品造成辐照损伤。
能量过滤器是一个磁透镜和能量选择性狭缝（slit），slit宽度越窄最终图像的衬度和信噪比就越好，但是也会损失一定信号，现在常用slit为10-20 eV。
由于非弹性散射电子速度更慢，受磁透镜影响更大，能量过滤器能够过滤非弹性散射的电子，使得只有弹性散射和非散射电子参与最终成像，提高图像的衬度。
Reference: https://myscope.training